الهندسة الوراثية : مبادئها ، تقنياتها وتطبيقاتها

تصميم
نص البرنامج : الهندسة الوراثية : مبادئها وتقنياتها
- تحديد مراحل نقل مورثة واستنتاج مفهوم التغير الوراثي من خلال تعرف :
 كيفية انتقال مورثات Agrobacterium tumefaciens إلى نبات.
 مراحل نقل مورثة إلى بكتيرية معينة.
- تعرف بعض مجالات تطبيق مبادئ الهندسة الوراثية :
 الإنتاج الصناعي لهرمون النمو والأنسولين البشري؛
 الإنتاج الصناعي لبروتينات سامة توجه ضد الحشرات الضارة؛
 الرفع من المردود الزراعي بواسطة المتعضيات المعدلة وراثيا

الدرس

الهندسة الوراثية : مبادئها وتقنياتها

1. مبادئ وتقنيات الهندسة الوراثية
1.1. مفهوم التغير الوراث
* دراسة مثال الإنتقال الطبيعي لمورثات Agrobacterium tumefaciens إلى نبات
* دراسة مثال افنتاج الصناعي لبروتينات سامة لمحاربة الحشرات الضارة
* استخلاص مبدإ الهندسة الوراثية : مفهوم التغير الوراثي
2.1. التقنيات المستعملة في تحويل مورثة الى خلية معينة
* المرحلة 1 : عزل المورثة المرغوب فيها
* المرحلة 2 : ادماج المورثة داخل ناقل معين
* المرحلة 3 : تلميم المورثة المرغوب فيها
* المرحلة 4 : رصد الخلايا المغيرة أي التي أدمجت المورثة المرغوب فيها وتلميمها
* المرحلة 5 : تعبير المورثة المنقولة وتوظيفها لإنتاج المادة المرغوب فيها
2. تطبيقات الهندسة الوراثية
1.2. الميدان الطبي :
* الإنتاج الصناعي للجزيئات ذات الغرض الصيدلي
* الإنتاج الصناعي للهرمونات ( هرمون النمو GH والأنسولين البشري )
* الإنتاج الصناعي للمشتقات الدموية
* الإنتاج الصناعي لجزيئات تتدخل في آليات الدفاع المناعتي واللقاحات
* الطرق الحديثة في التشخيص القبل - ولادي
2.2. الميدان الغذائي – الفلاحي
* الإنتاج الصناعي لبروتينات سامة توجه ضد الحشرات الضارة
* تحسين المردود الزراعي : مورثة مقاومة ضد الطفيليات ومبيدات النباتات
مورثة تساعد على التثبيت المباشر للآزوت الهوائي
خلاصة : تعريف الهندسة الوراثية










الهندسة الوراثية : مبادئها ، تقنياتها وتطبيقاتها
1. مبادئ وتقنيات الهندسة الوراثية

1.1. مفهوم التغير الوراث

* دراسة مثال الإنتقال الطبيعي لمورثات Agrobacterium tumefaciens إلى نبات .
- ملاحظات


جرب السنخ





قبل الإصابة بالجرب

بعد الإصابة بالجرب


يظهر على بعض النباتات ورم أو جرب ناتج عن تكاثر عشوائي (سرطاني أي غير مراقب) لبعض الخلايا ويسمى جرب السنخ .



مستعمرة من البكتيريا Agrobacterium tumefaciens

ملاحظة بالمجهر الإليكتروني للبكتيريا
Agrobacterium tumefaciens ( A.T )

في منطقة الجرب نجد بكتيريات من نوع Agrobacterium tumefaciens .

- بنية وتعضي الخلية البكتيرية

خصائص الخلية البكتيرية : مثـــالEscherichia Coli ( E.Coli ) التعليق
البكتيريا Escherichia Coli متعضي مجهري ذو بنية بسيطة يعتبر من الدوات المفضلة من طرف علماء البيولوجيا في البحث عن بنية المورثات وكيفية عملها
- طولها : 2m
- وزنها : 10-12 g
- خلية بدون نواة حقيقية
- الدخيرة الوراثية مكونة من :
* صبغي رئيسي واحد طوله 1mm وهو عبارة عن جزيئة ADN غير مرتبطة بالبروتينات ، يتوفر على تقريبا 106 الى 107 زوج من النيكليوتيدات و 4000 مورثة .
* بلاسميدات عبارة عن جزيئات من ADN حلقية الشكل وصغيرة القد ، قادرة على النسخ الجزيئي الذاتي ويمكنها أن تنتقل من خلية الى أخرى مخترقة الأغشية البكتيرية .
- عدد كبير من الريبوزومات منتشرة داخل السيتوبلازم تمكنها من قدرة انتاج هائلة للبروتينات
- تكاثر سريع بحيث في الظروف المثلى ، تنقسم الخلية كل 20 دقيقة واذا استمرت هذه الظروف نحصل خلال أقل من يومين على كتلة توازي كتلة الأرض أي 6.1021 طن . عدد كبير من البكتيريات تتوفر إضافة الى جزيئة ADN الطويلة المكونة للصبغي الرئيسي على أجزاء من ADN الصغيرة والمعزولة والحلقية أي البلاسميدات


الذخيرة الوراثية للبكتيري

- تحديد مختلف وظائف المورثات المكونة للبلاسميد Ti


صورة اليكترونوغرافية لـبلاسميدات بكتيرية

الخريطة الورثية للبلاسميد Ti
- تتوفر البكتيريا Agrobacterium tumefaciens على ذخيرة وراثية مكونة من :
صبغي رئيسي دائري
و عدة بلاسميدات تسمى Ti صغيرة الحجم متشابهة دائرية ولها القدرة على التضاعف الذاتي .
- يحتوي كل بلاسميد على عدة مورثات ، لكل مورثة وظيفة معينة وأهمها :
المورثة VIR : وظيفة الحدة ، تمكن البلاسميد الدخول الطبيعي وانتقال المورثة ADN-T الى الخلايا النباتية
المورثة OR : وظيفة التضاعف
المورثة ONC : وظيفة التكاثر الخلوي المتواصل ( الورمية )
المورثة OPS : وظيفة تركيب الأوبينات
المورثة OCC : وظيفة استعمال الأوبينات من طرف البكتيريا


البلاسميد Ti جزيئة صغيرة من الـ ADN حلقية الشكل تحمل مورثات اضافية غير المورثات التي توجد في ADN الصبغي الرئيسي .
يمكن للبلاسميد أن يكون من أصل بكتيري أو من أصل حموي ( فيروسي ) مثل العاثيات  أو من أصل كائن حي من ذوات النواة الحقيقية مثل بلاسميد الخميرة الذي يحمل اسم دائرة 2 ميكرون ( cercle à 2 microns le plasmide ) .

- تفسير كيفية الإصابة بجرب السنخ :
التعليق الإستنتاجات
عندما تدخل البكتيريا ( A.T ) الى النبات على إثر جرح ، تعمل على حقن المورثات ADN-T الموجودة بالبلاسميد Ti والتي تندمج بكيفية تلقائية داخل المادة الوراثية للخلية النباتية
اندماج وتعبير المورثة ADN-T يؤدي من جهة الى تركيب كمية كبيرة من الأوبينات من طرف الخلايا النباتية وتحريرها في الوسط الخارجي واستعمالها من طرف البكتيريات ( A.T ) لنموها ومن جهة أخرى إصابة النبات بورم سرطاني يسمى جرب السنخ .
بعد موت النبتة تحرر مئات الآلاف من البكتيريات ( A.T ) التي تنتشر في التربة والتي يمكنها أن تصيب نباتات أخرى وتعاد الدورة من جديد . - تركيب الأوبينات من طرف الخلايا النباتية دليل على تعبير المورثة ADN-T
- تعبير المورثة ADN-T المسؤولة عن تركيب الأوبينات دليل على اندماج هذه الخيرة بكيفية تلقائية داخل المادة الوراثية للخلايا النباتية
- اندماج المورثة داخل المادة الوراثية واكتساب الخلايا النباتية صفة الورمية والقدرة على تركيب الأوبينات دليل على أن الخلايا النباتية أصبحت مغيرة وراثيا





* دراسة مثال الإنتاج الصناعي لبروتينات سامة لمحاربة الحشرات الضارة

مثال : انتاج نباتات التبغ مقاومة للأسروعة Manduca sexta
ينتج نبات Nicotiana Tabacum التبغ أوراقا تستعمل لصناعة التبغ . تتعرض الأوراق للتلف بواسطة الأسروغة Manduca sexta


حشرة Manduca sexta ويرقاتها على نبات التبغ

يرقة حشرة Manduca sexta على نبات الطماطم

لإنتاج كميات وافرة من التبغ لابد من القضاء على الأسروعة التي تتكاثر بسرعة .

بينت تجارب أنجزت حول ظروف عيش الحشرة Manduca sexta أنها لا تستطيع العيش بوجود بكتيريا من نوع Bacillus thuringiensis .
قام الباحثون بعزل عدد من مكونات البكتيريا Bacillus thuringiensis ووضعها بوجود الحشرة Manduca sexta فتوصلو الى عزل مواد سامة تنتجها البكتيريا Bacillus thuringiensis وتقضي على هذه الحشرة : هذه المواد هي عبارة عن بروتينات تشكل بلورات داخل البكتيريا وتؤدي الى تحلل خلايا الأنبوب الهضمي للأسروعة .
قام الباحثون بتحديد المورثة المسؤولة عن تركيب البروتين السام عند Bacillus thuringiensis .
لكن البكتيريا Bacillus thuringiensis غير قادرة على إصابة النبات وفي المقابل فإن البكتيريا Agrobacterium tumefaciens تتوفر على مورثات الحدة التي تمكمها من إصابة النبات .
البروتوبلاست خلية نباتية مجردة من جداها الهيكلي (الغشاء السيليلوزي) سهلة الإختراق من طرف البلاسميدات

 اعتمادا على هذه المعطيات ، اقترح طريقة يمكن لنبات التبغ أن يصبح بها قادرا على مقاومة الأسروعة .




- عزل المورثة المسؤولة عن تركيب البروتين السام المقاوم للأسروعة من المادة الوراثية للبكتيريا Bacillus thuringiensis .
- عزل البلاسميد Ti من البكتيريا Agrobacterium tumefaciens ودمج المورثة المسؤولة عن تركيب البروتين السام في هذا البلاسميد لأن البلاسميد يتوفر على وظيفة الحدة
- إعادة دمج البلاسميد في البكتيريا Agrobacterium tumefaciens
- وضع البكتيريا ت A.t التي تتوفر على البلاسميد الحامل للمورثة المسؤولة عن تركيب البروتين السام في وسط به بروتوبلاستات نبات التبغ . تستطيع البكتيريات الدخول الى البروتوبلاستات .
- زرع خلايا النبات ( البروتوبلاستات ) في وسط ملائم للحصول على شتلات جديدة مقاومة للأسروعة .

* استخلاص مبدإ الهندسة الوراثية : مفهوم التغير الوراثي
عند زرع وإعادة زرع نبات التبغ المحصل عليه نحصل دائما على نبات تبغ مقاوم للأسروعة ، لذا فإن صفة المقاومة المكتسبة أصبحت وراثية : يمكن أن نقول أن نبات التبغ قد تغير وراثيا ، هذا الصنف من النبات يصطلح عليه اليوم بالنباتات المغيرة وراثيا : Les OGM

2.1. التقنيات المستعملة في تحويل مورثة الى خلية معينة

يمكن تلخيص هذه التقنيات في المراحل التالية :
* المرحلة 1 : الحصول على المورثة المرغوب فيها بأحد الطريقتين التاليتين:
 الطريقة 1 : استخلاص المورثة المرغوب فيها بقطع ADN بواسطة أنزيمات خاصة تسمى أنزيمات الفصل النوعي
سنة 1912 اكتشفت لأول مرة أنزيمات الفصل النوعية من طرف Werner Arber .
توجد عدة أنزيمات تقطع ADN الى عدة أجزاء تسمى أنزيمات الفصل
بينت الدراسات أن أنزيمات الفصل تقطع في مواقع محددة من ADN لذا تسمى أنزيمات الفصل النوعي .

ADN من المادة الوراثية للإنسان لم يتعرض للقطع ADN من المادة الوراثية للإنسان تعرض للقطع ADN عاثية تعرض للقطع طوله (50kb)






يعطي الجدول أمثلة لأنواع مختلفة من أنزيمات القطع
انزيم القطع موقع القطع على متتالية النيكليوتيدات البكتيريا مصدر الأنزيم
Age 1 ACCGGT
BamH1 GGATCC Bacillus amyloliquefaciens
EcoRI GTTAAC Escherichia coli
Cfr101 PuCCGGPy
Hpa2 CCGG Haemophilus parainfluenzae
Hind3 AAGCT Haemophilis influenzae
Kpn1 GGTACC Klebsiella pneumoniae
Nae1 GCGGTC
Pst1 CTGCAG Providencia stuarti
Sac1 GAGCTC
Sal1 GTCGAC Streptomyces albus G
Sma1 CCCGGG Serratia marcescen
Sph1 GCATGC
Xba1 TCTAGA
Xma1 CCCGGG Xanthamonas malvacearum
 يشير السهم لموقع القطع

مثال أنزيم الفصل النوعي EcoRI وقد تم عزله من البكتيريا Escherichia coli
بعد قطع ADN بواسطة أنزيمات الفصل لابد من البحث عن المورثة المرغوب فيها من بين القطع المحصل عليها ، لذا يتم تحضير مجس خاص بالمورثة وهو قطعة من ARNm متكاملة مع جزء من هذه المورثة




 عزل المورثة باستعمال مجس من ARNm المشع : مثال لمجس ARNm
يستعمل مثلا أنزيم القطع النوعي 1 Pst الذي يقطع ADN في 5 مواقع مختلفة

لفصل الأجزاء فيما بينها: تستعمل تقنية الهجرة الكهربائية Elèctrophorése .

يسلط على الأجزاء المقطوعة مجس ARN المشع (له القدرة الارتباط بجزء ADN المرغوب فيه)












 الطريقة 2 : تركيب المورثة انطلاقا من ARNm بنسخه على شكل خيط مكمل أو ADNc باستعمال الأنزيم الناسخ العكسي





 مضاعفة المورثة بواسطة تقنية PCR
يعتمد نجاح اندماج المورثة مع ADN الناقل على عشوائية اللتقاء هذين العنصرين . لضمان ارتفاع نسبة هذا الإلتقاء ونجاح الإندماج تستعمل نسخ عديدة من ADN المورثة مع نسخ عديدة من الناقل ، وهو ما يتطلب تحضير نسخ عديدة من المورثة .







تذبذب الحرارة خلال دورة محددة بين 40 و90 درجة
في حرارة 90 درجة تتلاشي الروابط الهيدروجينية بين القواعد الآزوتية المتكاملة فينفصل شريطي المورثة .
في حرارة 40 درجة يقوم أنزيم ADN polymérase ببلمرة شريطين جديدين وفق الآلية النصف محا فظة .
تتكرر نفس الدورة عدة مرات فيتم الحصول على نسخ عديدة من المورثة .
جهاز PCR مصمم لتوفير الظروف الملائمة لمضاعفة المورثة .

* المرحلة 2 : ادماج المورثة داخل ناقل الذي يمكن أن يكون بلاسميد بكتيري أو ADN عاثية .

- بلاسميد بكتيري :
قطع الناقل بواسطة نفس أنزيم الفصل ،
إدماج المورثة المعزولة والمقطوعة مع الناقل بواسطة أنزيم الربط ،
إدماج البلاسميد في البكتيريا .
- ADN عاثية ( فيروس أو حمة تستعمل البكتيريات للتكاثر )
قطع ADN العاثية بواسطة نفس أنزيم الفصل ،
إدماج المورثة المعزولة والمقطوعة مع ADN العاثية بواسطة أنزيم الربط ،
تسليط العاثية المغيرة على البكتيريا وهو ما يؤدي الى ادماج المورثة مع ADN البكتيريا




قطع ADN بواسطة أنزيم الفصل EcoRI




ربط ADN بواسطة أنزيم الربط

الحصول على قطعة ADN جديدة التركيب

تمرين تطبيقي :

أدى قطع ADN بواسطة أنزيمات الفصل الى تكون 3 قطع
C و B و A . تم عزل هذه القطع بواسطة تقنية الهجرة الكهربائية . تشير الأسهم الى مواقع القطع على ADN
 من بين النتائج 1 و 2 و 3 و 4 و 5 ، ما هي النتيجة المنتظرة
في هذه الحالة ؟



وضع خريطة لأنزيمات القطع على ADN الناقل .
وضعت قطعة من ADN في محلول به أنزيمات القطع Sal1 و / أو Kpn1 . تعطي الوثيقة نتيجة الهجرة الكهربائية بعد اضافة مجسات للقطعة المحصل عليها.
الأجزاء المقطوعة بعد الهجرة الكهربائية

خريطة أنزيمات القطع على ADN

 انطلاقا من نتيجة الهجرة الكهربائية ضع خريطة أنزيمات القطع على القطعة الكاملة لـ ADN .


3 : أنزيم القطع النوعي
4 : ADN المورثة
5 : أنزيم ناسخ عكسي
6 : أنزيم الربط
7 : صبغي رئيسي
8 : بلاسميد
9 : انزيم القطع النوعي
10 : فتح البلاسميد
11 : بلاسميد مغير
12 : بلاسميد غير مغير

أ : عزل المورثة
ب : عزل البلاسميد الناقل
ت : دمج المورثة في البلاسميد
ج : دمج ابلاسميد في البكتيريا






 طريقة عمل أنزيمات الفصل وأنزيماتن القطع












* المرحلة 3 : تلميم البكتيريات الحاملة لـ ADN المغير

زرع البكتيريات الحاملة لـ ADN المغير وإعادة الزرع عدة مرات حتى الحصول على لمات ( اللمة هي مستعمرة بكتيرية أصلها من انقسام بكتيريا واحدة ) تتوفر على المورثة المرغوب فيها
يؤدي التكاثر البكتيري الى تكاثر البلاسميدات ومعها تتكاثر المورثات ال .

* المرحلة 4 : رصد الخلايا المغيرة أي التي أدمجت المورثة المرغوب فيها وتلميمها
للتعرفعلى البكتيريات المغيرة وراثيا ، تستعمل مجسات مشعة ترتبط بالمورثة المرغوب فيها ، ويتم رصد البكتيريات الحاملة لهذه المورثات بواسطة تقنية التصوير الإشعاعي الذاتي



* المرحلة 5 : تعبير المورثة المنقولة وتوظيفها لإنتاج المادة المرغوب فيها
مسدس المورثات
ملحوظــــــة : هناك طريقة ثانية لتغيير الخلايا وراثيا وذلك
عزل المورثة المرغوب فيها ونسخها بواسطة تقنية PCR
تهييء قنابل مكونة من المورثات المغلفة بالذهب او بـ tungstène وقنبلة الخلايا بواسطة مسدس المورثات .



2. تطبيقات الهندسة الوراثية

1.2. الميدان الطبي :

* الإنتاج الصناعي للهرمونات ( هرمون النمو GH والأنسولين البشري )
هرمون النمو لمعالجة القزمية
هرمون الأنسلين لمعالجة مرض السكري
العامل 8 والعامل 9 المتدخلان في تخثر الدم : لمعالجة مرض الناعورية





* الإنتاج الصناعي للمشتقات الدموية
أنزيمات تحول نظام الفصائل الدموية A, B و AB الى فصيلة وحيدة O ، وهو ما يحل مشكل قلة عينات الدم لبعض الفصائل الدموية
* الإنتاج الصناعي لجزيئات ذات الغرض الصيدلي
لقاح الكباد B : ادماج مورثة تنتج مضادات اجسام ترتبط نوعيا بحمة الكباد B الشيء الذي يمنع ارتباط الحمة بسطح الخلايا الكبدية

* الطرق الحديثة في التشخيص القبل - ولادي
تشخيص احتمال الإصابة بسرطان الثدي وبسرطان القولون (المعي الغليظ) .



تتجلى أهمية تطبيق الهندسة الوراثية في الميادين الطبية في كونها تنتج مواد ذات جودة عالية
2.2. الميدان الغذائي – الفلاحي

* الإنتاج الصناعي لبروتينات سامة توجه ضد الحشرات الضارة
* تحسين المردود الزراعي : مورثة مقاومة ضد الطفيليات ومبيدات النباتات
مورثة تساعد على التثبيت المباشر للآزوت الهوائي
* في الميدان الغذائي :
تسبب المواد المؤكسدة ( les oxydants ) عدة أمراض في الجسم مثل السرطانات وأمراض القلب والشرايين والأمراض المرتبطة بالشيخوخة
يمكن رفع نسبة مضدات التأكسد في نبات الطماطم بتغيير مسلك تركيب الفلافونويدات ( flavonoïdes ) وذلك بتغيير النبتة لتصبح منتجة لأنزيم la chalcone isomérase الذي يرفع ب حوالي 78 مرة إنتاج مضادات التأكسد





خلاصة
الهندسة الوراثية والأخلاق


الهندسة الوراثية أم المكافحة البيولوجية المندمجة : الحفاظ على التوازنات الطبيعية

Manduca sexta parasitized by braconid wasps